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Détection des corps lipidiques par microscopie de 3ieme harmonique

Observer les corps lipidiques et la morphogénèse de tissus non marqués par microscopie de troisième harmonique

La microscopie multiphotonique s'est progressivement imposée comme une technique essentielle pour visualiser l'activité cellulaire au sein de tissus intacts. Au-delà de l'imagerie de fluorescence, d'autres modes de contrastes sont explorés, qui permettent d'obtenir des informations complémentaires, en particulier sans avoir recours à des marqueurs exogènes. Une équipe animée par E. Beaurepaire au Laboratoire d'Optique et Biosciences (INSERM U696/CNRS UMR7645; Dir : J-L. Martin) de l'Ecole Polytechnique s'est intéressée aux mécanismes de contraste d'une technique récente, la microscopie par génération de troisième harmonique (THG). A l'échelle tissulaire, cette méthode d'imagerie permet de mettre en évidence les interfaces et inclusions micrométriques[1,2]. On peut ainsi obtenir une cartographie des tissus et visualiser la morphogenèse d'embryons de Drosophile sans avoir recours à un marquage fluorescent[3](*). A l'échelle cellulaire, ces travaux ont montré que le signal de troisième harmonique permettait de détecter spécifiquement les vésicules lipidiques présentes dans de nombreux tissus (foie, poumon, embryons, graines)[1](*). Des études récentes mettent en évidence le caractère dynamique et hautement régulé de ces organelles jusqu'ici peu étudiées. Outre leur rôle dans la physiologie végétale, les corps lipidiques sont impliqués dans de nombreux processus sains et pathologiques dans les cellules animales. Cette « nouvelle vision » des tissus offerte par la microscopie THG peut naturellement être obtenue simultanément avec d'autre signaux multiphotoniques, tels que la fluorescence cellulaire ou le second harmonique produit par les fibres de collagènes, et devrait se prêter à de nombreuses applications en physiologie.

Images 3D en génération de troisième harmonique (THG) et fluorescence excitée à deux photons (2PEF) d'un embryon de Drosophile vivant. Ces images révèlent la ségrégation des gouttelettes lipidiques entre les cellules en formation et les structures internes du vitellus pendant le processus de cellularisation. Combinée à la microscopie à deux photons, la microscopie THG permet de visualiser le trafic des gouttelettes lipidiques depuis la région des noyaux vers la surface du vitellus, puis leur recolonisation des cellules juste avant la gastrulation.

Orange: gouttelettes lipidiques non fluorescentes (THG)
Vert: noyaux marqués par GFP (2PEF)
Bleu: structures fluorescentes internes du vitellus (2PEF)
Gris: fluorescence de la membrane vitelline (2PEF)

(*) Résultats obtenus dans le cadre de la thèse de D. Débarre, en collaboration avec le laboratoire de physico-chimie du vivant (CNRS UMR 168, Institut Curie, Paris, équipe E. Farge), le laboratoire de signalisation cellulaire et calcium (INSERM U757, Orsay, équipe L. Combettes), et le laboratoire de pneumologie et d'anatomie-pathologie (INSERM U700, Hôpital Bichat, Paris, équipe B. Crestani).

[1] "Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy " D. Débarre, W. Supatto, A.-M. Pena, A. Fabre, T. Tordjmann, L. Combettes, M.-C. Schanne-Klein & E. Beaurepaire Nature Methods 3, 47 (2006). Abstract

[2] "Structure sensitivity in third-harmonic generation microscopy" D. Débarre, W. Supatto & E. Beaurepaire Optics Letters 30, 2134 (2005). Abstract

[3] "Velocimetric third-harmonic generation microscopy: micrometer-scale quantification of morphogenetic movements in unstained embryos" D. Débarre, W. Supatto, E. Farge, B. Moulia, M.-C. Schanne-Klein & E. Beaurepaire Optics Letters 29, 2881 (2004).Abstract