En poursuivant votre navigation, vous acceptez l'utilisation de cookies destinés à améliorer la performance de ce site et à vous proposer des services et contenus personnalisés.

X

Bioluminescence

Responsables: Pierre-Damien Coureux et Roxane Lestini

.L’ énergie chimique extraite des molécules organiques par les êtres vivants sert à de mul- tiples fonctions. Elle peut être transformée en énergie thermique, en énergie mécanique, en énergie électrique, voire en énergie lumineuse. Cette dernière propriété est plus répandue qu’on ne le pense en général puisqu’elle existe chez plusieurs centaines d’espèces vivantes aussi diverses que des bactéries, des champi- gnons et des animaux.

 Dans ce module expérimental, nous étu- dierons particulièrement la protéine verte fluorescente (GFP) de la méduse du paci- fique Aequorea victoria. Nous utiliserons les outils de génie génétique, de biochimie et de biophysique pour comprendre l’origine de cette fluorescence et comment l’exploiter dans divers    domaines biotechnologiques.

La luciférine de la queue de luciole Luciola lusitanica sera aussi abordée pour com- prendre l’origine et le mécanisme de sa bioluminescence.

Les 10 séances du module Bioluminescence s’organisent autour de 3 thématiques :

- Bioingénierie des protéines : introduction aux techniques de biologie moléculaire et de microbiologie pour la construction d’un vecteur d’expression de la GFP, une mutagénèse dirigée du gène de la gfp, la transformation des plasmides chez la bactérie, et la purification de la GFP à partir des bactéries.

Étude des caractéristiques biochimiques et optiques de la GFP et de ses mutants, analyse structure-fonction, et exemple d’application de la GFP dans l’imagerie cellulaire chez l’archée Haloferax volcanii.

 
- Introduction au système luciférine/lucifé- rase des lucioles.
 

À partir de queues de lucioles séchées, nous extrayons la luciférase et la luciférine et réalisons in vitro la réaction de biolumi- nescence telle qu’elle se produit chez les lucioles.

Nous nous intéressons ensuite à la GFP. En utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire, nous introduisons le gène de la GFP dans un plasmide pour permettre sa surexpression chez la bactérie Escherichia coli.

 Puis nous étudions les propriétés de fluorescence de la GFP. Nous introduisons des mutations au niveau du chromo- phore de la protéine et caractérisons leurs effets sur les propriétés de fluorescence. Deux mutants sont ainsi générés, l’un dont la fluorescence n’est plus verte mais bleu, l’autre dont le spectre d’excitation est modifié. A travers une analyse de la struc- ture tridimensionnelle de la protéine, nous chercherons également à comprendre com- ment certains acides aminés influent sur les propriétés de la GFP sans directement faire parte du chromophore. Ce type d’approche a permis d’obtenir des protéines fluores- centes de nombreuses couleurs. couleurs.

Différentes protéines GFP sont purifiées et leurs caractéristiques spectrales étudiées en mesurant leurs spectres d’absorption et d’émission.

Enfin, nous étudierons la localisation cellulaire d’une protéine clé de la réplication fusionnée à la GFP au sein de cellules vivantes de l’archée, H. volcanii, comme exemple de l’utilisation de la GFP comme outil en imagerie cellulaire.